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本期《袁来云云》为系列文章《大分子生物剖析概论》的第七篇，将重点就已揭晓的文献资料对抗体的总浓度和游离浓度的定量剖析及其在药代动力学中的应用举行起源的先容。
由于内容篇幅较长，本文将接纳上下篇形式举行推送，敬请垂注！《袁来云云》专栏系广州永乐国际医药微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为永乐国际医药子公司深圳博瑞副总司理袁智博士原创。
支持用于药物开发的生物剖析的主要驱动力是数据的预期应用。配体团结式测试要领（LBA）被普遍用于卵白质生物药和靶标配体（target ligands，L）的剖析，以支持药代动力学/药效学（PK/PD）和清静性评估。特殊是关于以非共价键团结其靶标配体的单克隆抗体药物（mAb），体内可以保存多种形式的mAb与其靶标配体，包括游离的mAb，游离的L以及mAb和L的一价和/或二价复合物（mono- and/or bivalent complexes of mAb and L）。
思量到给药后体内爆发的动态团结平衡的重大性以及在生物剖析历程中该平衡受到多种泉源的扰动，看待测物的差别形态（游离、团结或总体mAb和L）以间接体内形式（ex vivo）举行定量剖析得出的效果，可能与体内（in vivo）的现真相形差别。原则上，可以设计LBA试剂和测试名堂，用于测定mAb和L的总浓度或游离浓度。
本文主要关注mAb生物药与血液循环中以可溶形式渗透出来的，或从膜受体上脱落的靶标配体和L。本文从理论和实践上研究了怎样测定的总体/游离的待测物浓度，以提升科学界的相关认知，并提供了相关生物剖析战略，以便在药物开发的特定阶段提供所需的PK/PD的信息。
基于靶向药理机制的生物药已经成为了目今颇具远景的药物开发方法。生物药主要由单克隆抗体（mAb）药物组成，许多个mAb已经FDA批准作为药物上市使用，预计未来将有更多相关药物获得进入市场。
定量测定血液循环中的mAb及其靶标配体（L）的可靠剖析要领关于评估mAb的袒露量-响应关系、支持其有用性和清静性评价、治疗剂量的选择是至关主要的。配体团结测定法（LBA）通常用于定量剖析mAb及其相关L的浓度，在生物体内情形中保存多种形式的mAb和L，包括游离mAb、游离L和 mAb和L的一价和/或二价复合物。当L是二聚体或多聚体时，则会爆发特另外重大性，可以设计LBA试剂和剖析名堂来举行丈量，包括mAb及其L的团结及游离形态。这其中，确定LBA要领所丈量简直切形态至关主要。
由于LBA的数据是用于评估药代动力学/药效学(PK/PD)关系，因此，为了适当评估PK/PD，使用相关的剖析要领清晰地剖析mAb和L的相互作用是很是主要的。本文形貌如下相关共识
同时，本文为选择mAb和L的总体和游离浓度的测定要领提供了一个适用的战略，将从以下方面叙述:
生物体液中游离、部分游离（partially free，也称为部分团结/ partially bound），团结（bound）所有（total）mAb和L的术语。关于mAb，将其“游离/free”部分适用性地界说为体现出与其未团结形式（unbound forms）相等同的生物活性的形式。由于mAbs的二价性，游离mAb既包括未团结（unbound）mAb，也包括部分团结mAbs（即一价团结的/monovalently bound），这些形式通常是使用未团结的参考标准物（unbound reference standards）来定量的。总体mAb将是完全团结形式（fully bound）、部分团结形式（partially bound）和非团结形式（unbound）的总和。
除了与mAb团结外，L还可以与其它卵白质团结，并且L上可能有多个团结位点，具有或不具有协同效应。为了简化讨论，本文将不讨论L的多价团结（multivalent binding）和与近端卵白（proximal protein）团结。在此，本文简化了靶标配体，L，的定量，只包括“游离”(非团结，Lfree)和总体(包括与mAb团结和非团结的形式，Ltotal)；响应的参考标准物由特定的要领来确定。
虽然本文提供了一些文献中的案例研究和例子，但目的不是要包括万象。为了阻止文章冗长，不会详细讨论表1中的例子，只作为参考文献列出。有兴趣的读者可参阅相关文献。
生物剖析战略的主要驱动力是使用这些数据为药物开发举行决议参考。取决于决议所需要的信息，在药物开发的差别阶段所需的数据以及因此所选择的定量要领（游离，所有，或两者都要）可能差别。
在药物开发的早期阶段，特定的试剂可能无法用于开发游离的mAb或L的剖析要领。因此，生物剖析科学家和数据使用者应相识并就下列问题举行交流:
(1)生物剖析数据的预期用途；
(2)血液循环中mAb和L之间的动态平衡关系；
(3)剖析要领的手艺性挑战（technical challenges）及着实际局限性（practical limitations）。
在临床前开发阶段, 血清mAb的浓度用于建设非临床物种中的PK行为，并展望首次人体给药（FIH）时的起始剂量 (表2)。靶标配体L的浓度用于评估mAb与L的动态平衡关系，以资助确定具有生物活性的mAb浓度，并用于PK建模，从而确定给药剂量和计划。
临床阶段的数据则用于形貌人体药代动力学特征，界说PK/PD与清静性和有用性的关系，并在目的患者人群中建设PK/PD模子，以支持药物的批准上市和使用以及药品标签。详细的PK/PD数据的应用列于表2和表3。
在许多情形下，生物药的药理效应是由游离的mAb和mAbfree所决议的。若是mAb与可溶性配体团结，以避免其与同源受体团结（或通过其转达信号）。若是能够在游离靶标配体与Lfree的团结与临床响应之间建设起相关性，与L的团结和捕获就可以作为PK/PD建模和给药计划选择时一个直接的生物标记物。虽然 mAbfree反应了mAb在体内的游离状态和团结能力，但评估mAbtotal可以进一步资助形貌mAb与L之间的动态相互作用。mAb/L的比值与其动态平衡（dynamic equilibrium）高度影响生物剖析要领的特异性。因此，相识药物开发差别阶段所需的信息是十分主要。
药代动力学家通常对mAbfree颇为敏感，由于mAbfree的水昭雪映了可使用的活性药物。虽然，毒理学家也对mAbtotal很是敏感，由于mAb的靶向或脱靶效应（on- or off-target effects）可能带来清静隐患。因此，在使用这些数据之前，药代动力学家和毒理学家必需相识详细的生物剖析要领是什么，并决议是否需要举行特另外剖析。
就此而言，若是在药物开发的后期改变了定量剖析要领，那么可能需要重新评估PK或PD模子，由于这些模子是基于特定的定量剖析要领爆发药物浓度-时间行为。从游离或团结的mAb的剖析要领的角度，有综述剖析了21个FDA已批准上市的mAb药物的LBA要领。这些报告大多没有详细说明剖析要领的名堂，因此差别剖析要领爆发的PK参数可能纷歧致。
由此来看，在制订mAb的生物剖析战略时，主要的是与差别功效团队中的要害利益攸关方相助。包括药物开发项目所处的阶段，何时以及怎样测定每个药物开发项目中的mAb和L。
质量作用定律支配着mAb和L的团结。
该定律首先是由Guldberg和Waage于1864年提出，并被普遍用于形貌可逆性团结的相互作用（reversible binding interactions）：从steroid hormones与其团结卵白，到mAb和L的可逆性团结。一样平常选择对靶标配体（L）的有高团结亲和力（binding affinity）的mAb作为药物来开发，平衡解离常数(equilibrium dissociation constants，Kd)通常在几个nM到pM的浓度规模。团结动力学一样平常是非线性的、容量有限的（capacity limited），其团结切合二级动力学特征（second-order association）。
其中，Kd和Ka划分为平衡解离常数和团结常数。
质量作用定律可用于盘算或展望平衡中各组分的浓度。Le Chatelier原理也形貌了平衡随浓度转变而移动的趋势。图1批注，mAb团结到L的部分（fraction of mAb bound to L），除取决于Kd外，还取决于mAb和L的浓度比值。
图1. 在一定的mAb/L摩尔比规模内，mAb-L亲和力对 mAbfree的影响。将L的浓度牢靠为常数，用于模拟盘算 mAbfree。为了便于诠释，本例中的摩尔比是基于假设每摩尔药物有一个团结位点；关于mAb，每摩尔药物有两个团结位点。
图1. 在一定的mAb/L摩尔比规模内，mAb-L亲和力对 mAbfree的影响。将L的浓度牢靠为常数，用于模拟盘算 mAbfree。为了便于诠释，本例中的摩尔比是基于假设每摩尔药物有一个团结位点；关于mAb，每摩尔药物有两个团结位点。
在给药后，一样平常假定mAb与可溶性L的团结遵照质量作用定律。因此，可以定量剖析血浆或血清样本中mAb和L的浓度，以剖析PK/PD关系的动态平衡。如在《药物和靶点生物剖析数据的应用》章节中所讨论的，凭证质量作用定律的展望，mAb或L的体内平衡将以依赖于PK动力学和L的响应动力学的方法，向游离或团结状态移动，如表4所示的情形分类。高比例的mAb/L的第一种情形是高剂量的mAb与L具有高团结亲和性，这是药物开发中经常遇到的情形。 但在某些情形下，L可能会累积并在某些时间点导致mAb/L比值降低。Lfree和/或Ltotal的增添可能在给药后陪同L的积累而爆发，并可能抵消抑制L的预期效果，或可能带来其他清静问题。
除了思量给药后mAb-L团结的体内动力学外，离体状态（ex vivo conditions）如样品收罗、贮存、运输和样天职析等可能使样本的平衡状态与体内（in vivo）状态大不相同。表5列出了一些可能影响团结或解离平衡动力学的状态。
在样品收罗和剖析历程中，由于平衡可能受到扰动，差别mAb和/或L的相关形式（游离的、团结的、总L和mAb）的离体定量可能会偏离体内的现实值。别的，误差的水平取决于研究历程中样本收罗的时间，因此，很难展望由这样的实验确定的PK/PD行为与体内的真实状态的相似水平。
在含有这些差别形式的混淆物的样本中，并且当很难控制mAb和/或L的特定形式的平衡动力学时，将平衡驱动到主要以mAb和L的游离或团结(总体)的形式保存，然后举行定量剖析的价值较大。别的，使用疏散办法来疏散游离的和团结的形式，并定量特定的形式，以获得药物开发的每个阶段所需的PK或PD信息。许多LBA检测平台和条件都足够无邪，可以完成这项事情。
本文后续将划分在《抗体药物的定量生物剖析要领》和《靶标配体的生物剖析要领》章节中，讨论针对mAb和L的详细形式的多种定量要领。敬请垂注！
粤公网安备 44011202001884号
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